DNA磷酸化试剂盒说明书
产品编号：BTN130813
规格：20T
产品及特点：
人工合成的PCR 引物、linker 和adaptor 的5′端一般都是-OH 基团而不是-PO4基团（除非额外付费要求在人工合成时加上-PO4 基团），而任何DNA 连接酶都不能将一个DNA 分子5′端的-OH 基团和另一个DNA 分子3′端的-OH 基团进行连接，因此通过人工合成的DNA 片段和天然DNA 之间的连接效率一般都比天然DNA 彼此的连接效率低（天然DNA 4 个端口均可连接，人工合成的DNA 跟天然DNA 有2 个端口可以连接，人工合成的DNA 之间没有任何端口可以连接），尤其是在平末端连接时。本公司开发的DNA 磷酸化产品能将DNA 分子5′端的-OH 基团磷酸化。它具有下列特点：
1. 可以快速把DNA 5′端的-OH 基团变成-PO4 基团，使人工合成的DNA（包括PCR产物）跟天然DNA 一样有高的连接效率。
2. 既可以对单链DNA 进行磷酸化处理，也可以对双链DNA 片段同时磷酸化处理。
3. 处理后的DNA 可以直接用于连接反应、克隆等，不需要纯化。
4. 本产品足够20 次DNA 的磷酸化实验。
规格及成分：

成分	规格
10×TPK 缓冲液	50μl
ATP 溶液（10 mM）	100μl
T4 多核苷酸激酶（10U/μL）	20μl
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期为6 个月。
自备试剂：
引物、PCR 产物、DNA 片段。
使用方法：
一：双链DNA 片段（5’端为-OH 基团的）的磷酸化
注意：如果是PCR 产物，一定要先胶回收，不能使用没经过纯化的PCR 反应液，因为其中的残留PCR 引物会耗掉大量的激酶，降低PCR 产物的磷酸化效率。

1. 在微量离心管中配制下列反应液（20μL）：

成分	用量
PCR 胶回收片段	2μL（不超过10pmol）
10×TPK 缓冲液	2μl
ATP 溶液（10 mM）	5μl
T4 多核苷酸激酶（10U/μL）	1μl
超纯水到	20μl

2、37℃反应30 分钟。
3、70℃热处理5 分钟，灭活酶。
4、可直接用于后续克隆（加入量不要超过总体积的1/5）。
二：单链DNA 片段的磷酸化
注：单链DNA 包括局部双链的DNA。引物，linker，adaptor，Oligo 探针等均按此操作处理。

1. 在微量离心管中配制下列反应液（20μL）：

成分	用量
单链DNA片段	5-10 pmol
10×TPK 缓冲液	2μl
ATP 溶液（10 mM）	1μl
T4 多核苷酸激酶（10U/μL）	1μl
超纯水到	20μl

6、37℃反应30 分钟。
7、70℃热处理5 分钟，灭活激酶。
8、可直接用于后续克隆（加入量不要超过总体积的1/5）。如果使用浓度高，则可能需要乙醇沉淀法浓缩DNA。如果单链DNA 的浓度低于5pmol，还需要在乙醇沉淀时加入核酸助沉剂。沉淀得到的DNA 可溶解在适量的水中。
附：乙醇沉淀浓度DNA(本试剂盒不提供相关试剂，下列操作仅供参考：
1、在DNA 溶液中加入0.1 倍体积的3 M 乙酸钠溶液（pH 5.2）。
2、再加入2.5 倍体积的无水乙醇和4uL 核酸助沉剂。
3、混匀后12000g 4℃离心10 分钟，小心弃上清。
4、加入1mL 70%乙醇，短暂离心3 分钟后小心弃上清。
5、短暂离心5 秒，吸弃残留液体（约30-50uL）。
6、室温放置2 分钟干燥后加入适量的超纯水溶解DNA，立即使用或放-20℃长期保存。