一站式MBP标签蛋白纯化套装说明书
产品编号：BTN130871
规格：20次
产品及特点：
MBP（麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein）标签蛋白大小为40 kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10 mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒，它具有下列特点：
1. 一站式套装，含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
2. 提供 2 mL直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10 mg MBP蛋白/mL介质。
3. 采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
4. 本介质可以反复使用多次。
规格及成分：

成分	规格
直链淀粉-琼脂糖介质	2ml
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	25ml
0.1 M EDTA溶液	25ml
2 M NaCl溶液	50ml
蔗糖	20g
PMSF（10 mg/mL）	0.5ml
0.1 mM MgCl2溶液	50ml
0.1 M麦芽糖溶液	25ml
层析柱（6 mL）	1支
说明书	1份

保存条件：
常温运输和保存，但介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
去离子水、20%乙醇、0.22 μm 或0.45 μm滤膜。
使用方法：
1. 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10 mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中）。
2. 用5倍柱体积（柱体积指的是填料介质的体积，下同）自备去离子水洗柱，共3次。
3. 用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下（以10 mL为例）：

成分	用量	在结合缓冲液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	0.2 mL	20 mM
0.1 M EDTA溶液	0.1 mL	1 mM
2 M NaCl溶液	1 mL	200 mM
自备去离子水	8.7mL	-

4. 4℃ 5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀（约100 mg）悬于2 mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000 g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2 mL冰冷的细胞洗涤液中。（最好用不加诱导物的菌液做对照样。）细胞洗涤液的配方如下（以10 mL为例）：

成分	用量	在细胞洗涤液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	0.1 mL	10 mM
2 M NaCl溶液	0.15 mL	30 mM
自备去离子水	9.75 mL	-

5. 制备细胞裂解物：
1) 如果所用载体不带MBP信号肽序列（如pMAL-c2）
a) 超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温（0℃），直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。（超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。）
b) 为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35 μL PMSF（10 mg/mL）。
c) 4℃下13000-15000 g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
2) 如果所用载体带MBP信号肽序列（如pMAL-p2）
a) 4℃ 5000 g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1 mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下（以10 mL为例）：

成分	用量	在细胞裂解液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	0.3 mL	30 mM
0.1 M EDTA溶液	0.01 mL	0.1 mM
蔗糖	2 g	20%（m/V）
自备去离子水	加水到10 mL	-

b) 加入25 μL PMSF（10 mg/mL），室温搅动15分钟，于4℃ 13000-15000 g离心10分钟收集细胞。
c) 旋动细胞沉淀，加入2 mL冰冷的0.1 mM MgCl2溶液，4℃搅动10分钟。
d) 休克细胞4℃ 13000-15000 g离心10分钟，在上清中加入10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（可将1 M Tris-HCl，pH 7.4稀释100倍配制而成）至pH为7.4。
e) 上清用0.22 μm 或0.45 μm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（配方如上）4℃透析。
f) 收集透析后样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
6. 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中（保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
7. 用10-15倍柱体积的结合缓冲液（配方见上表）进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
8. 使用5-10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液（即目的蛋白组分）。麦芽糖洗脱液的配方如下（以10 mL为例）：

成分	用量	在麦芽糖洗脱液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	0.2 mL	20 mM
0.1 M EDTA溶液	0.1 mL	1 mM
0.1 M麦芽糖溶液	1 mL	10 mM
自备去离子水	8.7 mL	-

9. 将纯化得到的样品（包括流出液、洗杂液和洗脱液）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
10. 填料介质清洗：依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
蛋白酶切割释放靶蛋白（可选步骤，所用试剂需自备）
11. 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1) 加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子（根据融合蛋白中的位点选择）。每毫升介质中加入50单位的溶于1 mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。
2) 4℃以500 g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
3) 用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。