miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书
产品编号：BTN130911
规格：25T
产品及特点：
本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A 尾的方法来使miRNA 具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Tag 引物进行逆转录反应，最终合成miRNA 对应的第一链cDNA。其反应流程如下：
 
本产品具有如下特点：
1. 两步式操作，先进行Poly(A)加尾，再进行逆转录反应。
2. 只需要1 ug 的total RNA。
3. 所得cDNA 可用于检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。
4. 与miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒兼容。
5. 特异性好，独特的miRNA 引物及反应体系避免了Pre-miRNA 的非特异扩增。
 
 
规格及成分：

成分	规格
E.coli Poly(A) 聚合酶(5U/ μL)	10μl
10×Poly(A) 聚合酶反应液	50μl
ATP 溶液，1mM	50μl
Oligo（dT）-Tag 引物（0.5ug/μL）	25μl
MMLV 逆转录（含RI）	50μl
4×RT Buffer（含dNTP）	125μl
RNase-free 水	1ml

保存条件：低温运输，-20℃保存。
使用方法：
一、对miRNA 3' 末端进行加Poly (A)处理
1. 在冰上预冷RNase-Free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL。注意需要最后加入E.coli Poly(A)聚合酶。

试剂组份	体积
自备的Total RNA（见注）	1μg
10× Poly(A)聚合酶反应液	2μl
ATP 溶液，1mM	2μl
RNase-Free水	补水至20μL
E.coli Poly(A)聚合酶(5 U/μL)	0.4μL（2U）

注：在反应中使用的Total RNA 必须含有miRNA。也可以直接使用miRNA（建议加入量为2–5μL，需根据目的miRNA 的丰度决定）。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60 min。所得的反应液可以直接进行下游实验（注意：只能把2μL 直接用于后续的RT 反应，多于2μL 则需要先乙醇-乙酸钠沉淀，再将加尾后的miRNA 溶于水，然后再取所需量用于RT。如果不经过沉淀，带入的残留的poly（A）聚合酶反应液将会干扰RT 反应），也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。
二、对带Poly (A)尾巴的miRNA 进行逆转录反应
3. 按照下表设置20μL体系的RT 反应：

成分	体积
Poly(A) 反应产物（来于上步）	2μl
RNase-Free水	10μl
Oligo（dT）-Tag 引物	1μl
4×RT Buffer（含dNTP）	5μl
MMLV 逆转录酶（含RI）	2μl

4. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60 min。
5. 70℃保温10 min 终止反应。
6. 合成的cDNA 反应液可放置于-20℃保存；也可以暂时冰上放置，立即用于后续的荧光PCR 定量检测，不需要纯化。