超级杂交液(原位杂交)说明书
产品编号：BTN130906
规格：10ml
产品及特点：
原位杂交是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体；一个细菌；更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地gao辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位；用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。
本产品为百奥莱博开发的即用型原位杂交专用核酸杂交液。既可以用于RNA原位杂交、DNA原位杂交，也可以用于FISH原位杂交等试验。
规格及成分：

成分	规格
超级杂交液(原位杂交)	10mL
说明书	1份

保存条件：
低温运输和-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：
盖玻片、多聚甲醛等。
使用方法：
以检测mRNA序列为例。
培养细胞和冰冻切片
1. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2. 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO₂，所用培养基为DμLbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS （PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4. 30%H₂O₂ 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS （PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片加20μL预杂交液（提前加入鲑鱼精DNA，终浓度为100μg/ml）。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
注：靶DNA的变性
DNA-DNA杂交检测中，在杂交前需要增加靶DNA的变性步骤（对mRNA的原位杂交无需此步）。样品DNA的变性可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。可以将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，处理5-10 min，后冷却至37℃进行杂交。
8. 杂交——按每张切片20μL杂交液（探针浓度约为1ng/μL；杂交液提前加入鲑鱼精DNA，终浓度为100μg/ml），加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃ 0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10. 滴加封闭液：37℃ 30分钟。甩去多余液体，不洗。
11. 根据探针标记物，选择相应显色方法显色、复染，脱水、封片。
12. 结果观察。
石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H₂O₂ 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10 分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
5. 其余步骤和冰冻切片6-11步相同。
6. 结果观察。