DNA 5’末端标记试剂盒说明书
产品编号：BTN131036
规格：10T
产品及特点：
本产品为DNA 5’末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的DNA 或RNA 的5’末端进行高效标记反应。原理如下：
 
本产品具有下列特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的5’末端游离的OH 基团都能通过Kinase 反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于106 cpm/pmol(5’-end)的比活性。
规格及成分：

成分	规格
T4 多聚核苷酸激酶(10 U/μL)	20μl
5×交换反应缓冲液	100μl
10×磷酸缓冲液	50μl
Control DNA	20μl
说明书	1份

保存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
DNA 片段、γ-32P］ATP或其它的标记、未标记的ATPs、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等。
使用方法：
一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2. 在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的5’磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles 的5′末端)
5×交换反应缓冲液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

注：5 pmoles 的5’末端约等于0.17 μg 的长100 bp 的双链DNA。
3. 37℃反应30分钟。
4. 70℃加热5～10分钟使酶失活。
5. 加入 10 μL 的7 M CH3COONH4(pH 4.5)。如使用CH3COONa 做乙醇沉淀时使其终浓度达300 mM。
6. 加入 87.5 μL(2.5 倍)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7. 离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时，请在第8 步之后进行。
二、磷酸化反应标记
A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯仿、3 M NaCl 、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2. 在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	133 μL(≤10 μg)
1 M Tris-HCl，pH 8.0	15μL
牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，10～20 U/μL)	2μl
灭菌的超纯水	补足到150μL

3. 50℃反应30分钟。
4. 加入 150 μL 的TE 饱和酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。
5. 离心，取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入 7.5 μL 的3 M NaCl(最终浓度150 mM)。
8. 加入 375 μL(2.5 倍量)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9. 离心回收沉淀，用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20 μL 的TE Buffer 溶解沉淀。
B. 磷酸化反应(前反应)

• 在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA 片段	20.5μL(≤5 pmoles 的5′末端)
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10 U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。
三、合成DNA 寡核苷酸的标记
1. 在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
Oligonucleotide DNA with free 5’-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10 U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。
四、合成DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs 效果很好，它还能大幅减少小于20 个碱基的DNA 寡核苷酸和小于20 bp 的双链DNA 的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于 10个碱基的寡核苷酸。
注意事项：
1. 缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2. 5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3. 酶切得到的 DNA 片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4. 当用于交换反应的 DNA 在5 pmoles 以上(约1,000 bp 以上)时，标记效率有时会低于106 cpm/pmol。
5. 如果交换反应所用 DNA 低于500 bp 时，标记效率有时会有所降低。
6. 若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5′末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP 可用5 μL 的10 mM ATP 代替。
7. 磷酸化反应时的［γ-32P］ATP 可用［γ-35S］ATP 替代。
使用举例：
按照使用方法中交换反应和合成DNA 寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA 片段的放射自显影结果如下所示：