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BTN131039 即用型EMSA试剂盒
发布时间：2017-10-01 22:25 | 点击次数：621
即用型EMSA试剂盒说明书
产品编号：BTN131039
规格：100T
产品及特点：
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay），也称gel shift，是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。通过EMSA 可以研究目的蛋白和特定的DNA 序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。其原理如下：
本产品具有下列特点：
1. 一站式，使用方便，本试剂盒提供了进行 EMSA 实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA 上样液等主要试剂，使EMSA 实验变得简单方便。
2. 非特异性结合低，EMSA 结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。
3. 用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。
4. 本试剂盒足够标记 10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。
规格及成分：
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
待标记的EMSA 探针、用于探针标记的同位素、EMSA 胶配制的相关试剂等。
使用方法：
一、探针的标记：
1. 探针标记的反应体系如下：
按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex 混匀，再加入T4Polynucleotide Kinase，混匀。
2. 37℃反应10 分钟。
3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。
二、 探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA 的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
1. 对于 100 微升标记好的探针，加入1/4 体积（即25 微升)的5M 醋酸铵，再加入2 倍体积（即200 微升）的无水乙醇，混匀。
2. 在-70℃至-80℃沉淀1 小时，或在-20℃沉淀过夜。
3. 在 4℃，12,000g-16,000g 离心30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
4. 在 4℃，12,000g-16,000g 离心1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
5. 加入 100 微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。
三、 EMSA 胶的配制
1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。
最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA 胶的模具。
3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED 前先混匀，加入TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、 EMSA 结合反应：
1. 按照下表加入 EMSA 结合反应各成分：
2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25℃）放置10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
3. 加入1 微升EMSA 上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样。
注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA 的结合，建议尽量使用无色的EMSA上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、电泳分析
1. 用 0.5×TBE 作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10 分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的EMSA 上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10 微升稀释好的1×的EMSA 上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
3. 按照 10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4 处，停止电泳。
4. 剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA 胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1 分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA 胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
5. 在干胶仪器上干燥 EMSA 胶。然后用X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。
六、结果分析
上图为典型的EMSA 分析图，各上样孔介绍如下：
1. 为阴性对照反应(标记探针)；
2. 为常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
3. 为探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100 倍量的标记探针)；
4. 为突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100 倍量的未标记突变探针)；
5. 为Super-shift 反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。
产品编号：BTN131039
规格：100T
产品及特点：
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay），也称gel shift，是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。通过EMSA 可以研究目的蛋白和特定的DNA 序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。其原理如下：
本产品具有下列特点：
1. 一站式，使用方便，本试剂盒提供了进行 EMSA 实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA 上样液等主要试剂，使EMSA 实验变得简单方便。
2. 非特异性结合低，EMSA 结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。
3. 用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。
4. 本试剂盒足够标记 10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| T4 Polynucleotide Kinase | 100U |
| T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) | 100μl |
| Nuclease-Free Water | 1ml |
| 探针标记终止液 | 100μl |
| 5M 醋酸铵 | 600μl |
| EMSA 结合缓冲液(5×) | 200μl |
| EMSA 上样液(蓝色，10×) | 200μl |
| EMSA 上样液(无色，10×) | 200μl |
| TE 溶液 | 2ml |
| 说明书 | 1份 |
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
待标记的EMSA 探针、用于探针标记的同位素、EMSA 胶配制的相关试剂等。
使用方法：
一、探针的标记：
1. 探针标记的反应体系如下：
| 成 份 | 用量 |
| 待标记探针(1.75pmol/μL) | 2 μL |
| T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) | 1 μL |
| Nuclease-Free Water | 5 μL |
| [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/mL) | 1 μL |
| T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μL) | 1 μL |
| 总体积 | 10 μL |
2. 37℃反应10 分钟。
3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。
二、 探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA 的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
1. 对于 100 微升标记好的探针，加入1/4 体积（即25 微升)的5M 醋酸铵，再加入2 倍体积（即200 微升）的无水乙醇，混匀。
2. 在-70℃至-80℃沉淀1 小时，或在-20℃沉淀过夜。
3. 在 4℃，12,000g-16,000g 离心30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
4. 在 4℃，12,000g-16,000g 离心1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
5. 加入 100 微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。
三、 EMSA 胶的配制
1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。
最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA 胶的模具。
- 按照如下配方配制 20 毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1 等不同比例的Acr/Bis 对结果影响不大)。
| 成 份 | 用量 |
| TBE buffer(10×) | 1 mL |
| 重蒸水 | 16.2 mL |
| 39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) | 2 mL |
| 80% 甘油 | 625 μL |
| 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) | 150 μL |
| TEMED | 10 μL |
四、 EMSA 结合反应：
1. 按照下表加入 EMSA 结合反应各成分：
| 成 份 | 阴性对照 | 样品 | 探针冷竞争反应 | 突变探针 的冷竞争 反应 |
Super-shift反应 |
| Nuclease-Free Water | 7μl | 5μl | 4μl | 4μl | 4μl |
| EMSA 结合缓冲液(5×) | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 0 | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
| 未标记的探针 | - | - | 1μl | - | - |
| 未标记的突变探针 | - | - | - | 1μl | - |
| 目的蛋白特异抗体 | - | - | - | - | 1μl |
| 标记好的探针 | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
| 总体积 | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
3. 加入1 微升EMSA 上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样。
注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA 的结合，建议尽量使用无色的EMSA上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、电泳分析
1. 用 0.5×TBE 作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10 分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的EMSA 上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10 微升稀释好的1×的EMSA 上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
3. 按照 10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4 处，停止电泳。
4. 剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA 胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1 分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA 胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
5. 在干胶仪器上干燥 EMSA 胶。然后用X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。
六、结果分析
上图为典型的EMSA 分析图，各上样孔介绍如下：
1. 为阴性对照反应(标记探针)；
2. 为常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
3. 为探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100 倍量的标记探针)；
4. 为突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100 倍量的未标记突变探针)；
5. 为Super-shift 反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。