蛋白折叠试剂盒说明书
产品编号：BTN131121
规格：100T
产品及特点：
本产品由九种变性能力不同的缓冲液和七种添加因子组成，前者可防止蛋白聚集，后者可用于促进蛋白折叠回天然结构。本产品使用开放式实验设计，适用于筛选不同蛋白的最适折叠条件。本产品特点如下：
1. 可靠：所选缓冲液和添加因子是目前最常用的，普适性广。
2. 方便：采用两轮筛选，减少了工作强度。
3. 可调节：可以根据不同蛋白自行调整各种参数。
4. 即开即用：用户不需要单独配制各种溶液，简单快捷。
规格及成分：

成分	规格
基础折叠缓冲液A-I	9×10ml
二硫苏糖醇（DTT）	100mg
还原型谷胱甘肽（GSH）	120mg
氧化型谷胱甘肽（GSSG）	100mg
10mM聚乙二醇（PEG）	1ml
二价阳离子溶液（0.4M MgCl2 和0.4MCaCl2）	0.5ml
5 M NaCl溶液	1ml
100mMEDTA溶液	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
超纯水、包涵体纯化试剂盒、包涵体溶解液。
使用方法：
一、样品的准备
1、包涵体的纯化：一次筛选实验需要大约10-40 mg 纯度在80%以上的包涵体。本试剂盒不含包涵体纯化的相关试剂，但可另行从本公司购买。
2、包涵体的溶解：必须使用自备的包涵体溶解液（6-8 M 盐酸胍，50mMTris-HCl，pH 8.0）溶解包涵体以便跟本产品兼容。样品终浓度应该在10-20mg/mL，蛋白浓度可以用考马斯亮蓝法或OD280 光吸收法测定。
3、蛋白的纯化：若包涵体蛋白纯度高于80%，则跳过此步；若低于80%，则需要进一步纯化直到达到要求。对标签蛋白，可用标签蛋白相关纯化试剂盒或自配试剂纯化。对非标签蛋白，可用排阻层析方法纯化。纯化后的蛋白浓度在1-2 mg/mL 即可（作为低浓度样品）。浓度测定方法同上。
4、蛋白的还原：蛋白必须处于还原状态才能用于折叠实验。如果天然靶蛋白不含二硫键，所得溶液可直接用于折叠实验；如果天然靶蛋白含二硫键，并且纯度达标，则不需第3步的再纯化处理，但需要在第2 步的包涵体溶解液中再加入5-50mM的DTT 和1mM的EDTA以让错误形成的二硫键还原（如果需要纯化处理，则能不能加DTT 取决于是否影响后续纯化）。检查蛋白是否处于还原状态的方法是将同一样品分别用含还原剂和不含还原剂的SDS-PAGE 上样液上样进行肩并肩的SDS-PAGE 电泳来比较条带的清晰度。样品所含还原剂必须要在进行折叠实验前用自备的蛋白脱盐试剂盒脱盐去除，否则会影响折叠。
5、将处于变性和还原状态的蛋白溶液一管稀释到0.5-1.0 mg/mL作为低浓度样品，另一管稀释到10-20 mg/mL 作为高浓度样品，体积各450μL，放置冰上待用。
6、试剂的准备：DTT（MW=154.25）、GSH（MW=307.33）和GSSG（MW=612.64）均需要在使用前用超纯水分别配制成500mM、200mM 和100mM的溶液，分装成小管放-20℃保存。
二、第一轮筛选实验（筛选9 个变性强度、3 个还原条件和2 个蛋白浓度变量）
7、标记 18 个塑料离心管并按下表加入各成分，终体积是950μL（注意：此处EDTA、GSH、GSSG的用量只是作为参考，用户可以更改任何参
数，包括各成分用量和总体积。EDTA 可以维持氧化还原态的稳定，但如果蛋白含有金属辅因子，则需要将其删掉）：

样品管	基础折叠液	100mM EDTA	200mM GSH	100mM GSSG	超纯水
1	A型900μL	10μL	10μL	2μL	28μL
2	B型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL
3	C型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
4	D型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL
5	E型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
6	F型900μL	10μL	10μL	2μL	20μL
7	G型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
8	H型900μL	10μL	10μL	2μL	28μL
9	I型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL
10	A型900μL	10μL	10μL	2μL	28μL
11	B型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL
12	C型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
13	D型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL
14	E型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
15	F型900μL	10μL	10μL	2μL	20μL
16	G型900μL	10μL	5μL	10μL	25μL
17	H型900μL	10μL	10μL	2μL	28μL
18	I型900μL	10μL	10μL	4μL	26μL

8、混匀后冰上放置后，再在1-9 号管中各加入10μL 低浓度样品，在10-18号管中各加入10μL 高浓度样品。注意：每加一个样品后均需要立即震荡混匀再放冰上。
9、重复上步4 次直到加入到每个管子中加入的蛋白样品总量为50μL。
10、将 18 个离心管在4℃放18-24 小时进行蛋白折叠，结束后每管取部分样品用于折叠效果分析。注意：温度对其他因子的折叠效果有重大影响，故第一轮筛选时最好只用一个温度，在第二轮筛选时再变化温度。
11、将含有剩余样品的离心管转移到30℃继续水浴两小时，结束后每管取部分样品用于折叠效果分析。
12、将样品再转移到4℃放置，将每管的剩余样品用于折叠效果分析。
13、折叠效果分析：首先是目测或浊度计检查折叠反应液中是否有沉淀，沉淀越多一般表示折叠效果越差。此外还可以通过酶活性分析（需先将酶透析到合适的缓冲液中）、排阻层析、圆二色谱、荧光光谱等方法分析折叠效率。在最佳折叠条件下，蛋白的折叠率一般在30-80%。
14、如果上述初筛的结果不好，用户可改变条件（各成分用量）继续筛选满意的折叠条件，找到满意的折叠条件后，可进入第二轮筛选。
三、第二轮筛选实验（筛选PEG、DTT 和最佳温度）
第二轮筛选是基于第一轮筛选的结果。此处假设第一轮筛选后发现在基础折叠液A 和D 中折叠效果最好，在第二轮筛选需在此基础上进行。第二轮筛选要比较PEG/靶蛋白=0、2、4、6 四个条件和4℃、10℃、20℃、30℃四个温度。此处假设靶蛋白的MW=30Kd，则加入PEG 的量分别为0、6.7μL、6.7μL、6.7μL 即可得到上述比例。

• 标记8个塑料离心管并按下表加入各种成分，终体积是950μL 举例说明，用户可以更改任何参数，包括各成分用量和总体积:

样品管	基础折叠液	100mM EDTA	200mM GSH	100mM GSSG	10mM PEG	水
1	A型900μL	10μL	10μL	2μL	0	28μL
2	A型900μL	10μL	10μL	4μL	6.7μL	26μL
3	A型900μL	10μL	5μL	10μL	6.7μL	25μL
4	A型900μL	10μL	10μL	4μL	6.7μL	26μL
5	D型900μL	10μL	5μL	10μL	0	25μL
6	D型900μL	10μL	10μL	2μL	6.7μL	20μL
7	D型900μL	10μL	5μL	10μL	13.3μL	25μL
8	D型900μL	10μL	10μL	2μL	20μL	28μL

16、混匀后冰上放置后，再在1-8 号管中各加入10μL 浓度为1 mg/mL 的靶蛋白溶液。注意：每加一个样品后均需要立即震荡混匀再放冰上。
17、重复上步4 次直到加入到每个管子中加入的蛋白样品总量为50μL。
18、将 8 个离心管在4℃（或10℃、20℃、30℃）放18-24 小时进行蛋白折叠，结束后每管取部分样品用于折叠效果分析。
19、将含有剩余样品的离心管转移到30℃继续水浴两小时，结束后每管取部分样品用于折叠效果分析。
20、将样品再转移到4℃放置，将每管的剩余样品用于折叠效果分析。
四、其他筛选
金属二价离子一般会抑制大多数蛋白的折叠，但会促进少数蛋白的折叠。要比较其影响，建议在第一次筛选时每个反应体系中加2mM MgCl2 和2mM CaCl2,也可以第一轮不加，在第二轮时比较1mM EDTA、2mM MgCl2 和2mM CaCl2、4mM MgCl2 和4mM CaCl2 这三个条件。
盐离子（NaCl）强度对蛋白折叠，尤其是低浓度蛋白的折叠有较大影响，建议将比较盐离子的工作放在第二轮筛选。比较的浓度步超过300mM。
上述因子筛选实验的设计可以参考本手册第一轮或第二轮筛选反应。