DNA Shuffling试剂盒说明书
产品编号：BTN131178
规格：10T
产品及特点：
DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术，它以一个或多个基因为起始材料，通过先随机断裂成小片段，再进行互为模板和引物的PCR（无外加引物），最后再进行常规PCR（外加引物）等处理，最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。其原理示意图如下：
 
本产品就是根据上述原理优化改进而成，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板，无需单独准备各成分。
2.操作手册经过优化，1-2天即可完成，节省大量优化时间。
3.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
规格及成分：

成分	规格
PCR Mix 3.0，2×	1.5 mL
DNase I溶液（1U/μL）	10 μL
溶液A，10×	60 μL
溶液B，10×	60 μL
超纯水	1 mL
明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，保存期限一年。
自备试剂：
待突变基因片段、DNA Shuffling引物（第二轮PCR引物）、胶回收试剂盒。
使用方法：
1.待突变基因片段的制备：待突变基因片段可以用含此基因的质粒为模板、用PCR法或酶切法制备。制备时需保证含此基因（或此基因的一部分）的DNA片段总长度不要超过1kb，同时比DNA shuffling终产物（第二轮PCR产物）长200-400 bp。每次DNA Shuffling实验至少需要2 μg起始DNA片段（如果含几个基因片段，则彼此的比例为1:1），并且必须通过胶回收的方法回收，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。最后需用分光光度法准确定量。
2.提前准备37℃和75℃水浴，同时新鲜配制0.1U/μL的DNase工作液放冰上待用（必须在用时才配制，方法是将1 μL 本试剂盒提供的1U/uL的DNase I溶液和1 μL 溶液A和8 μL超纯水混合）。此溶液需在24小时内使用。
3.在一个离心管中，按顺序加入下列成分：

成分	用量
待突变基因片段（第1步制备）	2 μg
溶液A	5 μL
溶液B	5 μL
DNase I工作液（第2步制备）	2 μL
超纯水	36 μL

4.充分轻柔吹打混匀后37℃水浴8分钟，然后立即放75℃水浴处理10分钟以灭活DNase I。
5.在2-3%琼脂糖凝胶上电泳，用常规的胶回收法回收25-150 bp范围的所有片段待用。注意：一定要加合适的DNA marker以便确定片段范围，最好使用本公司生产的绿如蓝核酸染料（可见光型）作为电泳染料以避免用UV照射DNA，否则UV使DNA发生的交联将极大降低后续扩增效果。
6.分光光度法精确测定回收片段的浓度。
7.在PCR管中按顺序加入0.5 μg上步回收得到的回收片段、50 μL 2×PCR Mix、加超纯水到100 μL。
8.按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：

过程	温度	时间
PCR前变性	94℃	150 s
PCR反应 （40循环）	94℃	30 s
	47.5℃	45 s
	72℃	10 s，每次循环后增加5s
PCR后延伸	72℃	10 min

9.取5-10 μL进行电泳检测，然后进行PCR回收，得到第一轮PCR产物。
10.将回收的第一轮PCR产物1 μL原液作为模板设置3管第二轮PCR反应。

成分	用量
回收的第一轮PCR产物	1 μL
PCR Mix 3.0，2×	50 μL
自备DNA Shuffling引物	各1μM
超纯水	加水到100 μL

1. 按下列PCR参数进行第二轮PCR。

过程	温度	时间
活化	94℃	150 s
PCR反应 （25次循环）	94℃	30 s
	47.5℃	45 s
	72℃	60 s，每次循环后增加5s
PCR后延伸	72℃	10 min

1. 电泳检测，回收预期大小的PCR产物，用于后续的构建克隆文库实验（略）。

疑难解答：
Q：易错PCR和DNA Shuffling有何区别？
A：前者引入的是点突变，后者引入的是重组突变。示意图如下：