BTN131210 耐热型MMLV逆转录酶(H-)

耐热型MMLV逆转录酶(H-)说明书
产品编号：BTN131210
规格：1000U
产品及特点：
本产品为点突变型M-MLV 逆转录酶(RNase H 缺失)，拥有RNA 和DNA聚合酶活性，但由于在RNase H 结构域内进行了点突变，该酶缺少RNase H的活性，不会降解第一链CDNA 合成时形成的RNA-DNA 复合物中的RNA，从而可以从长模板中获得高产量的全长CDNA。缺失了RNase H 活性的逆转录酶为长cDNA 的制备及包含高比例全长cDNA 的文库制备提供了更好的选择。本产品具有下列特点：
1. 温度稳定性，点突变产物的热稳定性可防止与二级结构相关的问题，增强了与模板的亲和力。
2. 能够在较宽的温度范围内保持活性，在42-45℃之间具有最佳活性，在温度高达55℃时仍有活性。
3. 聚合酶活性增强，本产品与其它缺失突变得到的M-MLV 逆转录酶相比，具有更高的cDNA 产率。
4. 高产量制备全长的第一链cDNA，最长可达13kb。合成时可掺入带有修饰的核苷酸(例如 Cy3-、Cy5-、罗丹明-,、氨基烯丙基-、荧光素-标记的核苷酸)。
5. 广泛的工作范围：提高了逆转录的性能，使得可以在更广泛的酶浓度和底物浓度的条件下工作。
单位定义：
One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 10 min at 37℃.
反应条件:
50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 4 mM MgCl2, 10 mM DTT,50 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/mL [3H]-dTTP,0.4 mM polyA·oligo (dT)12-18灭活：
70℃10分钟。
储存缓冲液：
50 mM Tris-HCl (pH7.5)，0.1 M NaCl，1 mM EDTA，0.1% Triton X-100(v/v)，5 mM DTT，50%甘油(v/v)。
反应缓冲液：
[5×RT Buffer]250 mM Tris-HCl (25℃时，pH为8.3)，250mM KCl，20 mM MgCl2，50 mM DTT。
规格及成分：

成分	规格
耐热型MMLV 逆转录酶（H-），200U/μL	50μl
5×RT Buffer	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：RNA 模板、引物等。
使用方法：

• 在无 RNase 的PCR 管中加入如下成分：

成分	用量
RNA模板
Total RNA	0.1 ng-5 μg
或poly(A) RNA	10 pg-500 ng
或specific RNA	0.01 pg-0.5 μg
引物
Oligo dT18	0.5 μg (100 pmol)
或随机引物	0.2 μg (100 pmol)
或基因特异引物	15-20 pmol
RNase-free 水	Up to 12.5 μL

2. 对富含二级结构的高GC RNA 模板，65℃保温5 分钟后迅速冰浴2-10 分钟。
3. 离心数秒使反应液聚集于PCR 管底部。
4. 按顺序向上述反应液中加入下表各成分，反应终体积为20 μL：

5×RT Buffer	4 μL
RNase Inhibitor	0.5 μL（20 U）
dNTP Mix，10 mM each	2 μL (1 mM final concentration)
耐热型MMLV逆转录酶（H-）	1 μL（200 U）

轻柔混匀，短暂离心。
5. 42℃保温60 分钟（Oligo dT18 或基因特异引物）；如果是随机引物则先在25℃保温10 分钟，然后再转移至42℃保温60 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板保温温度可以设为55℃。
6. 70℃保温10 分钟终止反应后置冰上冷却，得到cDNA。该产物可直接用于PCR 扩增或-20℃保存。