零背景T载体说明书
产品编号：BTN131233
规格：20T
产品及特点：
本载体是经过独特改造的第二代T 载体，用户只需在一个PCR 引物上加上几个特殊的碱基，即可零背景克隆和定向克隆，只有当PCR 片段定向插入到本载体时，菌落才能生长，其他所有情况（如载体自连、目标PCR 片段的反向插入、非目标PCR 片段的正向和反向插入）下菌落均不能生长。原理如下：
 
本产品具有下列特点：
1. 零背景，阳性克隆率接近100%。
2. 连接效率高，30分钟可完成连接反应。
3. 简单，无需使用IPTG/X-Gal 进行蓝白筛选。
4. 连接产物可直接用于细菌转化。
5. 用途广，可用于PCR 产物克隆、TA 克隆、克隆后的DNA 测序、定向克隆。
6. 提供引物一对，可直接用于菌落PCR 检测。
格及成分：

成分	规格
克必隆零背景T 载体，（50 ng/μL）	20μl
高效连接液	150μl
引物1	50μl
引物2	50μl
说明书	1份

 
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
DNA片段等。
使用方法：
DNA片段的克隆实验

• 在微量离心管中配制下列溶液，总体积为5μL。

成分	用量
克必隆零背景T载体	1μl
DNA片段	0.05 pmol～0.2 pmol
dH2O	up to 5μL

注：在进行克隆时，Vector DNA 和Insert DNA 的摩尔比一般为1：2～10。
PCR 片段扩增用的2 条Primer 除了含有扩增目的片段用的序列外，还要在其5’端均加入TTTAA 5 个碱基。当进行定向克隆时，可以选择其中1条Primer 的5’端加入TTTAA 5 个碱基。
2. 加入 5 μL（等量）的高效连接液。
3. 16℃反应30分钟。注：室温（25℃）也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；长片段PCR 产物（2 kb 以上）进行DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
4. 全量（10 μL）加入至100 μL 的JM109 感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5. 42℃加热45 秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6. 加入 890 μL 的SOC 培养基，37℃振荡培养60分钟。
7. 在含有Amp 的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
8. 挑选菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注：由于Insert DNA 片段末端必须带有序列TTTAA，DNA 片段成功插入至克必隆零背景T 载体中后，bla 基因得以表达，因此使用本载体在Amp 抗性平板上生长的菌落基本都是阳性克隆，如果有必要进行阳性克隆检测时，建议使用PCR 方法，扩增用引物可以使用随本产品提供的引物即可，对菌落直接进行PCR 扩增。
疑难解答：
Q：怎样提高连接转化效率？
A： 1. 确认Insert DNA 片段的3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA 聚合酶（KOD、Pfx、Pfu 等）扩增的PCR 产物是平滑末端，不能直接进行TA 克隆。
2. 纯化PCR 产物。最好使用切胶回收的PCR 片段，以除去PCR 产物中的非特异性片段和引物等杂质。
3. 请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA 的感受态细胞。
4. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA 的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。
5. 进行切胶回收纯化DNA 片段时，不要使DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。
6. 高效连接液尽量避免反复冻融。
7. 建议使用新配制的平板培养基。
8. 确保Insert DNA 两端均带有TTTAA 序列。
Q：欲对克隆DNA 片段进行测序时，使用何种引物？
A: 建议使用随本产品提供的引物对进行目的片段测序反应。
Q: 目的DNA 片段要亚克隆至其它载体（如：表达载体等），酶切位点应怎样选择？
A: 因载体上无多克隆酶切位点，进行亚克隆时，酶切位点可以根据亚克隆载体的情况进行选择。进行PCR 扩增时，应在PCR 扩增用引物上预先引入合适的酶切位点，克隆至本载体后再使用该限制酶切下目的DNA 片段，
然后亚克隆至目的载体中。
注意事项：
1. PCR 片段扩增用的2 条Primer 除了含有扩增目的片段用的序列外，还要在其5’端均加入TTTAA 5 个碱基。当进行定向克隆时，可以选择其中1条Primer 的5’端加入TTTAA 5 个碱基。
2. 克隆时使用的Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR 产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA 克隆效率 。
3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μL。当要转化的DNA 量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA 后再进行转化。
4. 连接反应请在25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。
5. 本产品来源于pUC19 载体，因此，适合pUC19 载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109 等。
6. 本制品是利用β-lactamase 缺失进行筛选，所以对筛选平板使用的氨苄青霉素（Amp）的质量要求较高，请使用高品质的氨苄青霉素（Amp），工作浓度为100 μg/mL。不要使用配制时间过长的氨苄青霉素（Amp）或平板。