BTN131235 Klenow片段（3′→5′exo-）

Klenow片段（3′→5′exo-）说明书
产品编号：BTN131235
规格：200U
产品及特点：
Klenow片段是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了DNA 聚合酶活性，具有 3’→ 5’外切酶活性，但不具有 5´→3´ 外切核酸酶活性。可以在DNA模板和引物存在的条件下，选择性地催化底物 dNTP沿5’→ 3’方向合成与模板互补的 DNA。本产品是重组表达得到，它具体有下列用途：
1.双链DNA5’突出末端的平滑化。
2.用随机引物制备探针。
3.随机引物标记法。
4.寡核苷酸定向诱变（Oligonucleotide directed mutagenesis）中双链DNA的合成。
5.双脱氧法DNA序列测定（Sanger法）。
规格及成分：

成分	规格
Klenow片段（5U/μL）	20μl
10×Klenow Fragment Buffer	1ml
明书	1份

活性定义：
以合成的Poly d(A-T) DNA为模板/引物，在37℃、pH7.4 的条件下，30分钟内使 10 nmol的全核苷酸掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位(unit)。
活性定义反应液：
67mM磷酸钾、pH7.4、6.7 mM MgCl2、0.1mM DTT、20uM DNA模板、33 uM dATP，33uM【³H】dTTP
纯度：
1.10 units的本产品和1 μg的超螺旋pBR322 DNA(Form I)在37℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
2.SDS-PAGE：＞95%。
酶储存buffer：50 mM 磷酸钾，pH 6.5，1 mM DTT，50%甘油10×Klenow Fragment Buffer： 100 mM Tris-HCl，pH7.5、70 mM MgCl2、1 mM DTT。注意：本buffer可用于标记或末端平化等常规实验，与活性定义所用的buffer组成不同。
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
模板DNA；引物。
使用方法：
使用举例：随机引物的同位素标记反应
1.在微量离心管中配制下列反应液

成  份	用量
模板DNA	25 ng
随机引物(6-9 mer)(1 nmol/μl)	2 μL
补超纯水到	14 μL

2.95℃保温 3 分钟。然后冰中急冷 5 分钟。
3.加入2.5 μl 10×Klenow Fragment Buffer。
4.加入2.5 μl dNTP (0.2 mM dATP,dGTP,dTTP)。
5.加入5 μl 111 TBq/mmol [α-32P].dCTP (3000 Ci/mmol)(1.85 MBq, 50 μCi)
6.加入1 μl本产品，反应液共25 μl。
7.37℃反应3小时。
65℃加热5分钟。反应液可直接作为探针使用。如有必要，可以通过用北京天恩泽柱式探针纯化试剂盒除去未反应的标记的dCTP。
注意事项：
1． 本酶有高度稳定性，稀释时不失活，但剧烈搅拌会失活。
2． 由于不含有 5′→ 3′的外切核酸酶活性，因此没有切口平移活性。
3． 可用于双链DNA末端以及缺口（Gap）的修复。
4． 与T4 DNA Polymerase 相比，对模板高级结构的抵抗性能较好。
5． 由于对DNA 的亲和性较强，过量使用易发生凝集作用（Aggregation）从而抑制反应进行。
6． 若用于 5′突出末端的修饰时，补平后有时会多加一个碱基。
7． 与DNA Polymerase I相同，ddNTPs 的掺入不受底物抑制。