细胞周期与凋亡检测试剂盒（PI法）说明书
产品编号：BTN131296
规格：50T
产品及特点：
本产品是一种采用经典的碘化丙啶染色(Propidium Staining，即PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。其制备原理为：碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。基于上述原理，本试剂盒的特点为：
1.细胞检测。通常应用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测。若用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，需将组织消化成单细胞状态，再进行检测。
2.样品处理量大。本试剂盒足够检测50个样品，每个样品的细胞数量可以为10-100万。。
规格及成分：

成分	规格
染色缓冲液	25ml
碘化丙啶染色液(20%）	1.25ml
RNase A(50×)	0.5ml

保存条件：
-20℃保存，有效期一年。碘化丙啶染色液(20%)需避光保存。如果4℃保存，则有效期为一个月。
自备试剂：
PBS和70%乙醇，均可向我公司订购。
使用方法：
一、细胞样品的准备：
1）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2）对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
二、细胞固定：
加入1毫升冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
三、碘化丙啶染色液的配制：
参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液：

成 份	1个样品	6个样品	12个样品
染色缓冲液	0.5 mL	3 mL	6 mL
碘化丙啶染色液(20%)	25 μL	150 μL	300 μL
RNase A(50×)	10 μL	60 μL	120 μL
终体积	0.535 mL	3.21 mL	6.42 mL

注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使用。
四、染色：
每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
五、流式检测和分析：
用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
注意事项：
1）本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测；
2）荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
3）碘化丙啶对人体有刺激性，请注意适当防护。