BTN160684 SuperTOPO平末端克隆试剂盒

SuperTOPO平末端克隆试剂盒说明书
产品编号：BTN160684
规格：25T/50T
产品及特点：
本产品是基于Topoisomerase 能够在几秒钟之内高速连接DNA 片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶，连接效率比野生型更高。本试剂盒具有下列特点：
1. 高效快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到100%。
2. 适用于pfu、KOD 等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 零背景，无需IPTG-X-Gal 蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal 培养基。
5. 本试剂盒按10 μL 标准反应体系，有25 次和50 次两种规格包装供选择。
6. 提供含Amp 和Kan 两种抗性的载体供选择（BTN160684-25A/50A 是含Amp抗性TOPO载体，BTN160684-25K/50K是含Kan抗性TOPO载体）。
规格及成分：

成分	25T	50T
SuperTOPO-Amp Blunt 载体	25μl（其一）	50μl（其一）
SuperTOPO-Kan Blunt 载体	25μl（其一）	50μl（其一）
连接缓冲液	25μl	50μl
M13F引物	50μl	50μl
M13R引物	50μl	50μl
超纯水	1ml	1ml
说明书	1份	1份

注意：BTN160684-25A/50A 提供SuperTOPO-Amp Blunt 载体，BTN160684-25K/50K 提供SuperTOPO-Kan Blunt 载体。
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
DNA 插入片段、感受态细胞、SOB 或LB 培养基（含抗菌素和不含的）。
使用方法：
1. 如果是PCR 制备插入片段，所用引物不能磷酸化，使用pfu、KOD 等产生平末端片段的高保真DNA 聚合酶。为保证扩增产物的完整性，PCR 循环结束后，再延伸5-10 分钟，确保片段延伸完全。
2. 电泳检测并相对定量PCR 片段（跟DNA marker 比较）。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的最佳用量：

插入片段长度	最佳用量
100-1000 bp	20-50 ng
1000-2000 bp	50-100 ng
2000-5000 bp	100-200 ng

3. 在一个干净的塑料离心管中，室温下（不要放在冰上）设置如下连接反应体系：

成分	用量
纯化后的PCR 产物	不超过8μl（详见注意事项）
SuperTOPO-Amp Blunt 载体或 SuperTOPO-Kan Blunt 载体	1μl
连接缓冲液	1μl
超纯水	补到10μL

注意：如果使用未经纯化的PCR 产物，则需要加入量不能超过1 μL，否则PCR 体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后，短暂离心，常温（20-30℃）放置0-5 分钟。如果在冬天室温低于20℃，建议使用25℃水浴或金属浴。注意：连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化，可以将离心管放-20℃保存。如果转化，则取5 μL 连接液加到50-100 μL 刚刚融化的感受态细胞中，轻柔混匀。注意：本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb，则不需要冰浴和热激，直接在离心管中加入500μL 不含抗菌素的SOC 或LB 培养基，然后取200 μL 涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100 μL 左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp（对SuperTOPO-Amp）或Kan（对SuperTOPO-Kan）的培养皿上，37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb，则按常规转化方式，先冰浴2-30 分钟，然后42℃热激30 秒，冰上防放置2 分钟，再在离心管中加入500 μL 不含抗菌素的SOC 或LB 培养基，37℃ 250 rpm 培养60 分钟，然后取200μL 涂盘。也可以先3000g 离心2 分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μL 左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp（对SuperTOPO-AmpBlunt 载体）或Kan（对SuperTOPO-Kan Blunt 载体）的培养皿上，37℃过夜培养。
8. 用M13F/M13R通用引物进行菌落PCR或直接测序来鉴定重组子。