BTN160680 无缝克隆试剂盒

无缝克隆试剂盒说明书
产品编号：BTN160680
规格：25T
产品及特点：
无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA 片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达95%以上。本产品特点总结如下：
1. 简单、高效地定向克隆DNA 片段。
2. 可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
3. 不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4. 省时，反应时间加转化时间短至20 分钟。
5. PCR 产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行重组反应，无需纯化。
规格及成分：

成分	规格
2×Seamless Mix	125μl
阳性对照DNA 片段I	10μl
阳性对照DNA 片段II	10μl
阳性对照线性化载体	10μl
超纯水	1ml
说明书	1份

保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
线性化载体、DNA 片段、感受态细胞、SOC 或LB 培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）。
使用方法：
1. 线性化载体的制备：
可通过单酶切、双酶切或PCR 扩增的方法来制备。（如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR 扩增的方法。）
2. DNA 片段的制备：
1) DNA 片段可通过PCR 扩增或酶切的方法制备，PCR 扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
2) PCR 扩增法引物设计原则：
A. 引物的 3‘端必须包含18-50 个能与模板DNA 结合的碱基序列，以便PCR 扩增出目的DNA 片段。
B. 引物的5‘端必须包含15-80 个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR 扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
3. 重组反应：
1) 按照如下体系操作：

自备的DNA 片段和线性化载体	0.5-5μL
2×Seamless Mix	5μL
超纯水	补足至总体积为10μL

2) 50℃反应15 分钟，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
注：线性化载体建议使用20-60 ng，DNA 片段按照与线性化载体摩尔比3：1使用。
4. 转化：
1) 取5 μL连接液至50-100 μL 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30 分钟。
2) 42℃水浴热激30 秒。
3) 立即放置于冰上静置2 分钟。
4) 加入 300-500 μL 无菌SOC 或LB 培养基（不含抗生素），37℃，200-250 rpm 振荡培养60 分钟。
5) 吸取 200 μL菌液涂板，为得到更多克隆，可先3000 g离心2分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37℃培养过夜（12-16小时）。
5. 用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。
6. 阳性对照反应（可选）
将本试剂盒提供的阳性对照DNA 片段和线性化载体按如下体系操作：

阳性对照DNA 片段I（600 bp，20 ng/μL） 或阳性对照DNA片段I（I 900 bp，30 ng/μL）	1μl
阳性对照线性化载体（2.8 kb，30 ng/μL）	1μl
2×Seamless Mix	5μl
超纯水	3μl

50℃反应15分钟，然后按照步骤4 转化涂板后用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定阳性重组子。