农杆菌GV3101感受态细胞说明书
产品编号：BTN140384
规格：0.1ml×10
产品及特点：
本产品为GV3101 农杆菌化学感受态细胞，其具有利福平和庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301 质粒检测转化效率高达104cfu/μg。
基因型：C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R/strep^R)Nopaline。
规格及成分：

成分	规格
农杆菌GV3101感受态细胞	0.1ml×10支
说明书	1份

保存条件：
干冰运输、-80℃保存，有效期一年。
自备试剂：
质粒DNA、液氮等
使用方法：
转化前准备
1. 冰水浴和 37℃水浴。
2. 液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在 28℃培养箱中平衡至少15 分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL 感受态细胞加1μg 质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置10 分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻 5 分钟（注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮）。
4. 迅速将离心管置于 37℃水浴静置中5 分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5 分钟。
5. 加入 800 μL 无抗生素的2×YT 或LB 液体培养基，28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6. 5000 rpm 离心1 分钟收菌，保留100 μL 左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72 小时。
注：当平板只含有50 μg/mL kan 时，28℃培养48 小时即可；平板中同时加入50 μg/mL kan，20 μg/mL rif 时，需 28℃培养 60h；如果使用的平板含有50 μg/mL rif 则需要 28℃培养 72-90 小时。
 
注意事项：
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 利福平浓度不应高于 25 μg/μL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有 50 μg/mL kan，若所用平板含有 20 μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti 质粒丢失的概率极低（可以忽略）。
6. 相关抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧苄青霉素（carb）	双蒸水溶解	50 mg/mL	50 μg/mL
硫酸卡那霉素（kan）	双蒸水溶解	50 mg/mL	50 μg/mL
链霉素（strep）	双蒸水溶解	10 mg/mL	50 μg/mL
利福平（rif）	DMSO溶解	10 mg/mL	20 μg/mL
庆大霉素（gent）	双蒸水溶解	20 mg/mL	40 μg/mL

表中抗生素均需要0.22 um 滤膜过滤除菌后方可使用。