酿酒酵母AH109感受态细胞说明书
产品编号：BTN140386
规格：0.1ml×10
产品及特点：
AH109 菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株，将lacZ 报告基因引入PJ69-2A 诞生了AH109，此菌株是Clontech 公司开发的GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1～174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7 的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ～881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。
GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N 端1 ～174 位氨基酸区段的DNA 结合域（DNA-BD）和位于C 端768 ～881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别GAL4-responsive gene 的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD 可以启动UAS 下游的基因进行转录。BD 和AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4 活性，使含有UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与AD 结合，将要检测的蛋白质分别与BD 和AD 融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。AH109 有四个报告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子（GAL1，GAL2，MEL1）启动，这三种启动子只有GAL4 识别的17bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为＞10⁴cfu/μg DNA。
菌株基因型如下：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3,MEL1 GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2,URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lacZ
规格及成分：

成分	规格
AH109 感受态细胞	0.1ml×10支
PGADT7，10 ng/μL	10μl
Carrier DNA，5 μg/μL	100μl
PEG/LiAc	5ml
说明书	1份

保存条件：
感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。
 
自备试剂：
目的DNA、YPDA、 SD 培养基等。
使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100 μL 感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入2-5 μg 预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc，吹打混匀，30℃水浴30 分钟（15 分钟时翻转6-8 次混匀）。
3. 42℃水浴15 分钟（7.5 分钟时翻转6-8 次混匀）。
4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30秒，弃上清。

• 取50 μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96 小时。

注意事项：
1. 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
2. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h 培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h 培养可见直径1mm 克隆。
4. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。