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BTN140390 酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞
发布时间：2017-10-03 17:39 | 点击次数：393
酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞说明书
产品编号：BTN140390
规格：0.1ml×10
产品及特点：
酿酒酵母Y2HGold 是Clontech 公司开发的GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα 型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。
Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和pGADT7。质粒pGBKT7 的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N 端1~174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7 的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C 端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(G1，G2，M1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。
Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
Y2Hgold的基因型是：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ,gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
规格及成分：
保存条件：
感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。
自备试剂：
目的DNA、YPDA、 SD培养基等。
使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100 μL 感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入2-5 μg 预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc，吹打混匀，30℃水浴30 分钟（15 分钟时翻转6-8 次混匀）。
3. 42℃水浴15 分钟（7.5 分钟时翻转6-8 次混匀）。
4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30秒，弃上清。
1. 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
2. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h 培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h 培养可见直径1mm 克隆。
4. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
产品编号：BTN140390
规格：0.1ml×10
产品及特点：
酿酒酵母Y2HGold 是Clontech 公司开发的GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα 型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。
Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和pGADT7。质粒pGBKT7 的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N 端1~174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7 的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C 端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(G1，G2，M1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。
Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
Y2Hgold的基因型是：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ,gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
规格及成分：
| 成分 | 规格 |
| Y2Hgold 感受态细胞 | 0.1ml×10支 |
| PGADT7，10 ng/μL | 10μl |
| Carrier DNA，5 μg/μL | 100μl |
| PEG/LiAc | 5ml |
| 说明书 | 1份 |
保存条件：
感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。
自备试剂：
目的DNA、YPDA、 SD培养基等。
使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100 μL 感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入2-5 μg 预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc，吹打混匀，30℃水浴30 分钟（15 分钟时翻转6-8 次混匀）。
3. 42℃水浴15 分钟（7.5 分钟时翻转6-8 次混匀）。
4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30秒，弃上清。
- 取50 μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96 小时。
1. 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
2. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h 培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h 培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h 培养可见直径1mm 克隆。
4. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。