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公司新闻

BTN140409 平末端克隆试剂盒(组成型)

发布时间:2017-10-03 17:42 |  点击次数:

平末端克隆试剂盒(组成型)说明书
产品编号:BTN140409
规格:20T
产品及特点:
本产品是一种先进的自杀基因阳性选择克隆系统,可以高效克隆平末端PCR产物和任何具有平末端的DNA片段。本试剂盒提供一个新颖的自杀基因阳性选择克隆载体--克必隆B载体(组成型)。其工作原理如下:
 
本产品具有下列特点:
1.采用自杀基因原理,无需蓝白斑筛选,零背景。
2.该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。
3.阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过95%的阳性重组克隆。
4.具有校正活性的聚合酶(如:Pfu DNA聚合酶,KOD DNA聚合酶)扩增的平末端PCR产物可直接连入克隆载体。
5.连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。
6.为方便酶切作图和插入片段基因操作,本克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。该载体含有T7启动子,可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。
格及成分:

成分 规格
B载体(组成型),40ng/µL 20μl
1000 bp对照,40ng/mL 5μl
2×快速连接缓冲液 100μl
T4 DNA ligase,5U/µL 20μl
正向测序引物(10µM) 100μl
反向测序引物(10µM) 100μl
说明书 1份
保存条件:
低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:
平末端PCR产物、感受态细胞等。
使用方法:
1.连接反应的准备
平末端PCR产物或者酶切后平末端片段可通过琼脂糖凝胶电泳分离回收(使用长波紫外光下切胶或者可见光透射切胶避免DNA损伤造成连接失败)。平末端PCR产物或平末端片段与载体的摩尔比是3:1。本公司生产的DNA产物快速纯化回收试剂盒(产品编号:90506)对50bp以上的DNA片段能很好地进行回收。
2.快速连接反应
3.在一个标准的10 L连接反应体系中,按下表加入各成分。
成分 对照 样品
2×快速连接缓冲液 5 mL 5 mL
B载体(组成型) 1 mL 1 mL
纯化后的PCR产物 - X mL
1000 bp 对照 1 mL -
T4 DNA Ligase 0.9 mL 0.9 mL
补水到 10 mL 10 mL
注:通常状况下,没有必要对PCR产物进行精确定量,一般PCR产物与载体的摩尔比优化至1:1~10:1就可以得到良好结果,推荐3:1。
2.2.22℃连接5-10分钟(一般可在PCR仪器完成)。通常推荐22℃连接5-10分钟,>3kb长片段连接可以延长至30分钟。不推荐超过30分钟,超过可能降低转化子数量。
2.3.冰上冷却,然后进行转化实验或贮存于-20℃。
3.转化
3.1.取100 L感受态细胞,置于冰上,完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。
3.2.加入4-5 L连接液(最多可全部加入,只要连接液体积不超过感受态细胞体积的1/10),轻轻混匀。冰上放置30分钟。
3.3.42℃水浴热激90秒。冰上放置2~3分钟。
3.4.加500 L LB或者SOC培养基(不含抗生素),37℃ 150 rpm振荡培养60分钟。
3.5.将200 L细菌涂布在氨苄青霉素(100 g/mL)平板上。涂布细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整,如果预计的克隆较少,可通过离心(4,000rpm,2分钟)后吸除部分培养液,留下适量的培养基悬浮菌体后取全部或者适量涂布于一个平板中(涂布剩余的菌液可以置在4℃保存,第2天如果转化菌落数量少,可将剩余菌液全部涂一个新培养板)。
3.6.平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体,然后倒置培养过夜。
4.筛选
4.1.常规检测:将得到的菌落接种1-5 mL LB(含有终浓度为100 g/mL的氨苄青霉素)培养基,37℃摇床振荡培养过夜,保存菌种后提取质粒,应用 PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
4.2.快速检测:挑取菌落直接进行PCR检测。具体步骤请参考我公司产品菌落PCR试剂盒2.0(BTN50901)使用说明书。
4.3 测序鉴定:使用试剂盒自带引物或者T7启动子引物测序确定是否含有目的克隆。
使用效果:
 
注:左图为使用本产品对17个克隆进行连接、转化实验,挑取菌落进行PCR,取10μL电泳结果图。M为Marker。
疑难解答:
Q:克必隆B载体(组成型)与克必隆B载体(诱导型)有何区别?
A:克必隆B载体(诱导型)的自杀基因是IPTG诱导表达;克必隆B载体(组成型)的自杀基因是组成型表达。