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公司新闻

BTN140632 活死细胞染色试剂盒(Calcein AM·PI)

发布时间:2017-10-03 17:43 |  点击次数:

活/死细胞染色试剂盒(Calcein AM·PI)说明书
产品编号:BTN140632
规格:1000T
产品及特点:
钙黄素AM(Calcein AM)是一种可对活细胞进行荧光标记的优良染色试剂,其能够轻易穿透活细胞膜。在钙黄素AM 存在活细胞内时,其特点就是由于胞内无所不在的脂酶活性作用,由几乎无荧光、具有细胞膜透性的钙黄素AM 生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质(Ex/Em:495 nm/520 nm)。
而对于受损的细胞膜来说,碘化丙啶(PI)可以进入细胞,与核酸结合,荧光信号从而放大40 倍,产生一个明亮的红色荧光信号的死细胞(Ex/Em:530nm/620 nm)。本产品是基于Calcein AM 和PI 的活死细胞染色试剂盒,通过检测细胞内酯酶活性和质膜完整性两个方面反映细胞活力,可用于动物细胞样品的活力和毒性检测。本产品具有下列特点:
1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分,操作简便、快捷、安全,灵敏度高。
2. Calcein AM 是最理想的活细胞的荧光探针,其细胞毒性很低。
3. 本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光多孔板、扫描仪、流式细胞仪以及其他荧光检测系统。
4. 本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞,包括贴壁细胞核某些组织,但不适用于细菌、酵母。
格及成分:

成分 规格
溶液A, 4 mM in DMSO 100μl
溶液B, 16 mM in DMSO 100μl
说明书 1份
保存条件:
低温运输,-20℃避光保存,有效期半年。
自备试剂:
PBS 溶液、0.1%皂角苷或0.1-0.5%的毛地黄皂苷。
使用方法:
一、荧光显微镜操作
1. 制备混合工作液(2μM溶液A, 8μM溶液B)
注:溶液A 和溶液B 的浓度选择依据所用的细胞类型不同而有区别,应当根据具体细胞调节染料浓度以得到最佳效果。一般来说,满足信号足够的前提下,尽可能选择最低浓度的染料剂量。溶液A 和溶液B的推荐浓度范围为0.1~10μM。
1) 取出溶液A 和溶液B 原液,室温平衡30分钟。
2) 取 5 μL 16 mM 的溶液B 原液加入至10 mL 的自备的PBS 溶液中,涡旋震荡混匀,得到8 μM 的溶液B工作液。
3) 将 5 μL 4 mM 的溶液A 原液加入到上一步的10 mL 的溶液B工作液中,涡旋,确保充分混匀。
4) 所得到的混合工作液(2 μM 溶液A, 8 μM 溶液B)可直接用于染色细胞。
注意:溶液A 的水溶液容易发生水解,应当当天用完。
2. 准备细胞,开展实验
1) 贴壁细胞可以用培养瓶或者小室爬片。非贴壁细胞同样可以。
2) 正式开始实验前,洗涤细胞,确保除去培养基中含有的活性酯酶。
用PBS 温和洗涤贴壁细胞,去除上清。非贴壁细胞用离心管收集离心,PBS 洗涤去除上清。
3) 加入足量的上述混合工作液,保证没过单层细胞。
4) 室温孵育30-45分钟。
5) 对于贴壁细胞,吸出染色工作液终止孵育。加入10 μL 的PBS至干净的载玻片,覆以盖玻片,以指甲油密封,防止水份蒸发。
6) 荧光显微镜下观察标记细胞。
3. 光学滤光片选择
Calcein AM 和PI 可以在传统的荧光长通道滤光器中被观察到,两者可以被分开观察到。各种滤光器的列表如下:
1) 长波和双发射滤波器有助于Calcein AM 和PI 同时观看:
Omega Filters:XF25,XF26,XF115
Chroma Filters:11001,41012,71010
2) 单独观察Calcein AM 的滤波器
Omega Filters:XF22,XF23
Chroma Filters:31001,41001
3) 单独观察PI 的滤波器
Omega Filters:XF32,XF43,XF102,XF108
Chroma Filters:31002,31004,41002,41004
二、荧光微孔板操作
1. 制备混合工作液(2 μM 溶液A, 8 μM 溶液B)
1) 取出溶液A 和溶液B 原液,室温平衡30分钟。
2) 取 5 μL 16 mM 的溶液B 原液加入至10 mL 的自备的PBS 溶液中,涡旋震荡混匀,得到8 μM 的溶液B 工作液。
3) 将 5 μL 4 mM 的溶液A 原液加入到上一步的10 mL 的溶液B工作液中,涡旋,确保充分混匀。
4) 所得到的混合工作液(2 μM 溶液A, 8 μM 溶液B)可直接用于染色细胞。
5) 如需单独计算活、死细胞比例请单独配置1mL 2μM 的溶液A工作液和1mL 8μM 的溶液B工作液。
2. 准备细胞,开展实验(每孔细胞的最低监测值大约为200-500 个,每孔最大常用细胞检测值约为106。)
1) 培养贴壁或者悬浮细胞。按照您的实验要求处理细胞。准备活细胞与死细胞的对照样品。死细胞可以用自备的0.1%皂角苷或0.1-0.5%的毛地黄皂苷处理10分钟得到。
2) PBS 洗涤细胞。对于贴壁细胞,加入100 μL PBS 覆盖孔底;对于悬浮细胞,可以直接在离心管中操作,再以PBS 重悬。将含有细胞的缓冲液,每孔100 μL 加入到微孔板各孔。细胞样品的洗涤注意要确保除去培养基中的活性酯酶,否则会引起背景。
3. 使用荧光酶标仪测量荧光(为了获得最佳的灵敏度,所使用的酶标仪,建议采用带光学过滤器的信号激发器,可保证不互相干扰。Calcein AM 可以用(485±10 nm)的荧光光学滤光器激发,而PI 可以用(530±12.5 nm)的典型罗丹明光学滤光器来兼容。而发射光信号可以通过滤光器得到很好的分开采集,Calcein AM 530±12.5 nm,PI 645±20 nm。)
1) 如有需要,准备对照实验样本的死活细胞百分比。如是测量死活细胞的相对增量,那么对照可以不用设置。对照样品可以有:无细胞对照(G、H),活细胞对照(E、F)和死细胞对照(C、D)。
2) 每孔分别加入100 μL 的溶液A 和溶液B 工作液,终体积为200μL,每孔含1 μM 的溶液A 和2 μM 的溶液B 的终浓度。室温孵育30-45分钟。
3) 用合适的激发和发射滤光片收集样本数据。
A. 645 nm,实验组细胞样本,同时标有Calcein AM 和PI=F(645) sam
B.530 nm,实验组细胞样本,同时标有Calcein AM 和PI=F(530) sam
C.645 nm,死细胞样本,只标有PI=F(645) max
D.645 nm,死细胞样本,只标有Calcein AM=F(645) min
E.530 nm,活细胞样本,只标有PI=F(530) min
F.530 nm,活细胞样本,只标有Calcein AM=F(530) max
G.530 nm,无细胞样本或不加染料=F(530) 0
H.645 nm,无细胞样本或者不加染料=F(645) 0
4. 结果分析
活细胞和死细胞的相对数量可以表示为在530 nm 下(在更长波长下荧光信号有限)的百分比或细胞绝对数,死细胞的特点是在600nm 下有强荧光信号,而530 nm 处有弱荧光信号。在计算结果之前,可以将背景的荧光读数F(530)0 和F (645)0 分别从F 值530和645 中减去。
活细胞的百分比可以定义为荧光读数的计算:
 
死细胞的百分比可定义为荧光读数的计算:
 
5. 计算绝对活死细胞数量
设置细胞数与荧光读数(530 nm)和(645 nm)的标准曲线,荧光强度与样本中的细胞数成线性正相关。
三、流式细胞仪
本试剂盒可以方便地应用于流式细胞仪。悬浮细胞或经胰酶消化的贴壁细胞,可以参见荧光显微镜染色操作步骤。对于流式的检测分析,通过PBS 离心洗涤细胞再以PBS 重悬,反复操作2 次之后,以溶液A 和溶液B 的工作液孵育悬浮细胞30-45分钟,即可上机检测。