免疫染色包括免疫荧光 (IF)、免疫组化 (IHC)、免疫细胞化学 (ICC) 等，可以参考如下步骤进行操作。
 

• 样品准备

• 对于贴壁细胞：
  可以直接用多孔板，例如 6 孔板、24 孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。
  也可以用洁净的盖玻片，70% 乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到 6 孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS 或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。

• 对于悬浮细胞：
  把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用 PDL 等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。

• 对于冷冻切片：
  切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

• 对于石蜡切片：
  脱蜡：切片脱蜡 5 分钟，共脱蜡 3 次。无水乙醇 5 分钟，两次。90% 乙醇 5 分钟，两次，70% 乙醇 5 分钟，一次。蒸馏水 5 分钟，两次。
  抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10 mM 柠檬酸钠，pH6.0，或 1 mM EDTA，pH8.0，或 10 mM Tris,pH10.0，95℃ 加热 12 分钟，大约在 30 分钟内缓慢冷却至室温。

• 固定
  可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如百奥莱博的免疫染色固定液 (YT086)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液 (YT089) 洗涤两次，每次 5 分钟。

• 封闭
  加入免疫染色封闭液 (YT087)，封闭 60 分钟。如果背景较高，可以 4℃ 封闭过夜。
  从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
  在整个免疫染色过程中我们推荐使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。

• 一抗孵育
  参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液 (YT088) 稀释一抗。
  用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或 4℃ 在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以 4℃ 缓慢摇动孵育过夜。
  回收一抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 5 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

• 二抗孵育
  参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液 (YT090) 稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色 (非荧光) 二抗稀释液 (YT091) 稀释辣根过氧化物酶 (HRP) 或生物素 (Biotin) 或碱性磷酸酯酶 (AP) 标记的二抗。
  用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或 4℃ 在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
  回收二抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 5 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

• 蛋白检测
  对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
  对于非免疫荧光染色可以选用 DAB 等适当的显色底物，或 AB 检测体系等进行后续检测。

• 多重染色
  如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如 DAB 染色，一般不适合再进行多重染色。
  多重荧光染色：
  可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠 Cy3(YT115) 进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔 FITC(YT109) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用 Hoechst 染色试剂盒 (YT118) 对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
  用 HE 染色进行复染：
  免疫荧光染色后可以用苏木素伊红 (HE) 染色试剂盒 (YT165) 进行 HE 染色。